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2021年03月02日，杜克大學醫學中心的分子遺傳學和微生物學系Stacy M. Horner教授團隊在《Cell Reports》（IF: 9.995）雜志發表了題為“Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine”的研究論文，研究通過MeRIP-seq（m6A-seq）等實驗揭示了m6A在抗病毒限制的I型干擾素（interferon，IFN）響應期間對IFN刺激基因（IFN-stimulated genes ，ISG）翻譯的轉錄調控機制。
標題：Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine
時間：2021.03.02
期刊：Cell Reports
影響因子：IF 9.995
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、Ribo-seq、MeRIP-qRT-PCR、熒光素酶活性分析實驗等
研究摘要
I型干擾素（interferon，IFN）通過誘導數百種IFN刺激基因（ISG）來響應病毒感染，必須調節這些ISG的誘導以實現有效和可調控的抗病毒感染響應，但這些基因的轉錄調控機制尚不明確。本研究首先鑒定了RNA堿基修飾N6-甲基腺苷（m6A）在ISG調控中的作用，通過Ribo-seq和定量質譜法結合m6A免疫沉淀測序（MeRIP-seq）分析，鑒定出包含IFITM1的ISG亞群，其翻譯通過m6A和m6A甲基轉移酶蛋白METTL3和METTL14增強。研究進一步表明m6A識別蛋白（readers）YTHDF1以m6A結合依賴性方式上調IFITM1表達，且m6A甲基轉移酶復合體可以促進I型IFN的抗病毒活性。總之，本研究表明m6A在抗病毒限制的I型IFN響應期間對ISG翻譯的轉錄調控中發揮作用。
實驗結果
（1）METTL3/14調節某些ISG的翻譯
IFN-β通過誘導ISG轉錄形成對病毒感染的響應。為研究m6A是否調節I型IFN響應，本研究對Huh7細胞中m6A甲基轉移酶復合體METTL3/14缺失后，IFN-β誘導的幾種具有抗病毒功能的ISG表達進行檢測。在METTL3/14敲除后，IFN-β誘導的ISG IFITM1和MX1蛋白表達降低（圖1A），同時在A549細胞、原代新生兒人真皮成纖維細胞（NHDF）和Huh7細胞中IFN-β處理后的多個時間點（8h、16h和24h）觀察到相似結果；但MX1蛋白水平在A549和NHDF細胞中的影響不如在Huh7細胞中強烈。而為響應IFN-β，METTL3/14過表達增加了Huh7細胞中的IFITM1和MX1豐度，但沒有增加ISG15和EIF2AK2的豐度（圖1B）。METTL3/14調節的ISG IFITM1和MX1在沒有IFN-β的情況下不表達，表明METTL3/14動態變化對內源性IFN-β的任何混雜效應可以忽略不計（圖1A和1B）。
圖1：METTL3/14調節某些ISG的翻譯
（A-B）在模擬或IFN-β（24h）處理之前，用siRNA轉染METTL3/14（M3/14）或對照（CTRL）（A）或穩定過表達FLAG-METTL14（M3/14OE；上箭頭表示FLAG-METTL14；下箭頭表示內源性METTL14）（B）的Huh7細胞提取物的免疫印跡分析。相對于非靶向對照（siCTRL）+IFN-β（A）或WT+IFN-（B），對A和B中4個重復的相對ISG表達進行定量。
（C-E）用CTRL或METTL3/14 siRNA轉染后經IFN-β處理的Huh7細胞提取物中分離24個蔗糖梯度級分中的IFITM1（C）、MX1（D）和GAPDH（E）mRNA相對百分比qRT-PCR分析。未初始化（游離、40S和60S亞基）、初始化（80S）、低分子量或高分子量多核糖體。右邊的圖表顯示了IFITM1、MX1或GAPDH組合級分中的mRNA百分比。將各部分的百分比相加得出各類別的總百分比。
數值為4個生物學重復（A和B）的平均值±SEM，3個技術重復平均值±SD，表示3個實驗（C–E，左圖）和3個生物學重復的平均值±SEM（C–E，右圖）。*非配對Student"s t檢驗（A和B）和Sidak多重比較檢驗的雙向方差分析（C–E），*p<0.05，***p<0.01，***p<0.005，ns，不顯著。
為研究METTL3/14如何調節某些ISG的蛋白水平，研究首先分析METTL3/14缺失是否導致ISG mRNA對IFN-β響應減少。同時，在IFN-β處理后使用RNA測序（RNA-seq），結果顯示METTL3/14缺失對核心ISG的mRNA表達豐度影響很小，表明ISG RNA穩定性不受METTL3缺失的影響。
由于METTL3/14缺失導致IFITM1和MX1蛋白減少而不影響其轉錄水平，本研究分析METTL3/14是否調節其蛋白穩定性。研究結果表明METTL3/14不能檢測到Huh7細胞中這些ISG的出核或蛋白質穩定性。
為了檢測METTL3/14是否調節IFITM1翻譯，作者檢測了其在對照細胞或IFN-β處理后METTL3/14缺失的細胞中的多核糖體（polysome）百分比。結果顯示METTL3/14缺失不改變總多核糖體水平，但METTL3/14缺失會導致80S級分中IFITM1 mRNA水平較低，且從重多核糖體級分轉換為輕多核糖體級分（圖1C），表明METTL3/14缺失后IFITM1翻譯受損。另外，在MX1（圖1D）中也觀察到類似但不太明顯的變化，但在GAPDH（圖1E）中沒有觀察到。總之結果表明，METTL3/14調節某些ISG的翻譯，如IFITM1和MX1。
（2）METTL3/14調節的ISG被m6A修飾
為確定METTL3/14調節的ISG IFITM1和MX1以及其他ISG是否被m6A修飾，研究通過使用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）在Huh7細胞中繪制了IFN誘導的轉錄組m6A圖譜，在鑒定出ISG后，將m6A免疫沉淀后reads覆蓋率的peaks，與使用MeTDiff m6A peaks calling的input進行比較。結果顯示mRNA peaks在編碼序列末端和3′UTR起始位點富集（圖2A）。peaks內最富集的RNA序列motif為[U/A]GGAC，這與DRAmC已知m6A motif匹配（圖2A）。約85%的ISG（分類為IFN后上調超過4倍的ISG）被m6A修飾，而Huh7細胞表達轉錄組中比例為74%（平均覆蓋率≥10）（圖2B）。該結果與先前的研究一致，該研究發現ISG以與轉錄組相似的百分比進行m6A修飾。m6A修飾的ISG百分比在其他類別的ISG中相似，包括脊椎動物中進化保守的“核心”ISG和具有已知抗病毒功能的核心ISG的14個亞群（圖2B）。接下來，利用MeRIP-seq數據生成了IFITM1、MX1、ISG15和EIF2AK2圖，并使用m6A peaks calling 方法MeTDiff和meRIPPer揭示METTL3/14調節基因IFITM1和MX1具有m6A peaks（圖2C和2D），而ISG15和EIF2AK2沒有m6A peaks（圖2E和2F），這些圖表明ISG15的3"UTR也可能包含m6A位點（圖2E）。將MeRIP-seq實驗中ISG的m6A狀態與已發表的研究數據進行比較，比較結果顯示在所有研究中核心抗病毒ISG的m6A狀態預測一致。dsDNA處理有效地激活IFN產生并誘導本實驗中發現的相同核心抗病毒ISG的m6A修飾。HCMV感染也導致某些ISG的m6A修飾，這種病毒編碼抑制IFN信號因子；因此ISG可能不像dsDNA或IFN-β處理那樣強烈誘導。m6A在許多ISG上的存在表明m6A可以調節抗病毒I型IFN響應。
圖2：METTL3/14調節的ISG由m6A修飾
（A） 在IFN-β處理（8h）后，轉錄組范圍內的m6A分布Metagene圖，繪制了具有統計學意義的peaks 中DRACH motif位點相對位置，以及peaks中最富集的motif。
（B） 在表達的轉錄組中由m6A修飾的基因百分比，響應于IFN-β處理（ISG）的mRNA誘導≥4倍的基因，脊椎動物中保守的核心ISG，或具有抗病毒功能的核心ISG亞群。
（C-F）在IFITM1（C）、MX1（D）、ISG15（E）和EIF2AK2（F）轉錄本中MeRIP（紅色）和input（黑色）reads覆蓋圖。生物學重復的差異由reads覆蓋范圍周圍的紅色和黑色陰影表示，灰色陰影表示編碼序列，黃色陰影表示由MeTDiff和meRIPPer的m6A peaks calling軟件。所有分析均在3個生物學重復上進行。
（3）IFITM1在3′UTR中的m6A修飾增強了其翻譯
m6A增強了某些mRNA的翻譯。具體而言，m6A識別蛋白（readers）YTHDF1在3′UTR內識別m6A，并與真核翻譯起始因子（如eIF3）結合，以增強m6A修飾轉錄本的翻譯。為METTL3/14對ISG的翻譯調節是否是通過m6A誘導，研究使用IFITM1作為METTL3/14調節的ISG模型。首先確定METTL3/14缺失對IFITM1 m6A修飾的影響。MeRIP-qRT-PCR結果表明IFITM1 mRNA在m6A陰性ISG EIF2AK2和m6A陰性合成RNA中富集，證實其含有m6A。METTL3/14缺失降低了IFITM1 mRNA的m6A富集，但沒有降低m6A陰性EIF2AK2轉錄本或m6A陰性合成RNA的富集（圖3A和3B），數據表明IFITM1是由METTL3/14修飾的m6A。
圖3：IFITM1在 3"UTR中的m6A修飾增強了翻譯
（A） 在用siCTRL或METTL3/14 siRNA處理并摻入m6A陰性（NEG）寡核苷酸的Huh7細胞中，由IFN-β（8h）誘導的ISG的相對m6A水平的代表性MeRIP qRT-PCR分析。
（B） A中5個生物學重復每個基因的相對富集百分比，歸一化為siCTRL。
（C） 野生型（WT）和突變型ISRE-m6A缺失的Renilla熒光素酶（R-Luc）IFITM1 3"UTR報告基因示意圖，該報告基因也從單獨的啟動子表達m6A缺失的螢火蟲熒光素酶（F-Luc）。
（D）經IFN-β（8h）處理的轉染Huh7細胞的WT和m6A-mut IFITM1 3"UTR報告RNA的相對m6A水平的MeRIP-qRT-PCR分析。
（E）用siRNA轉染的Huh7（24h）、然后進行報告基因轉染（24h）和用IFN-β處理（8h）的WT和m6A-mut IFITM1 3"UTR報告基因RNA的相對m6A水平的MeRIP-qRT-PCR分析，。
（F） 報告基因轉染（24h）和IFN-β處理（8h）后，在Huh7細胞中歸一化為HPRT1的WT和m6A-mut IFITM1 3"UTR報告基因mRNA表達的qRT-PCR分析。
（G） IFN-β誘導的WT和m6A-mut IFITM1 3′UTR報告基因中的相對螢光素酶活性（R-Luc/F-Luc）（相對于模擬8h）。
在鑒定出IFITM1是m6A修飾之后，接下來生成了一個熒光素酶報告基因，其中包含IFN刺激的響應元件（ISRE）-啟動子驅動的Renilla螢光素酶，所有DRAC motif被敲除（m6A-null R-Luc），然后與野生型（WT）IFITM1 3′UTR或類似的3′UTR序列結合，IFITM1中3′UTR m6A peaks中的四個推定m6A motif從A→G轉換（m6A-mut）（圖3C）。分析數據結果表明， METTL3/14通過向3"UTR添加m6A修飾來調節IFITM1翻譯，并且IFITM1 3"UTR內的m6A修飾足以增強其翻譯。
（4）YTHDF1以m6A依賴性方式增強IFITM1蛋白表達
為檢測YTHDF1是否誘導m6A對ISG的翻譯促進作用，研究人員在Huh7細胞中穩定過表達YTHDF1（H7Y1）或m6A結合缺陷型YTHDF1蛋白（H7Y1mut）并分析其相對于親本Huh7細胞（H7）在24h后IFN誘導的ISG表達。YTHDF1過表達增加響應IFN-β的IFITM1蛋白表達，而m6A結合缺陷型YTHDF1蛋白（H7Y1mut）的過表達不增加IFITM1豐度（圖4A和4B）。且野生型（WT）和突變型YTHDF1過表達不會顯著影響IFN-β處理后的IFITM1 mRNA水平，表明YTHDF1不直接調控IFN信號或IFITM1 mRNA穩定性（圖4C）。YTHDF1過表達顯著改變IFN誘導的含m6A的ISG MX1表達，或不含m6A的ISG ISG15和EIF2AK2表達（圖4A和4B）。而在IFN-β處理后，YTHDF1缺失會導致IFITM1蛋白表達降低，但MX1、ISG15和EIF2AK2未受影響（圖4D）。另外，WT YTHDF1與IFITM1、MX1、ISG15和m6A陽性對照SON的轉錄本結合，而m6A結合缺陷型YTHDF1突變蛋白則沒有結合。含有非m6A的mRNA EIF2AK2和RPL30不與任一蛋白結合（圖4E和4F）。總之，這些結果表明YTHDF1與IFITM1 mRNA上的m6A結合，且通過其m6A結合活性增強其翻譯是必要和充分的。YTHDF1與ISG15 mRNA明顯的m6A依賴性結合表明ISG15 mRNA實際上是m6A修飾。在ISG15 mRNA的input reads與MeRIP-seq reads的關聯圖揭示了其3"UTR中m6A富集的潛在區域（圖2E）。因此，YTHDF1在促進翻譯中具有轉錄本特異性作用，因為它結合了IFITM1、MX1和ISG15的轉錄本，但其過表達僅足以顯著增加IFITM1的蛋白生成。
圖4：YTHDF1以m6A依賴性方式增強IFITM1蛋白表達
（A） 在模擬或IFN-β（24h）處理后穩定過表達FLAG-YTHDF1 WT（Huh7Y1）或FLAG-YTHDF1 W465A（Huh7Y1mut）的Huh7細胞提取物的免疫印跡分析。
（B） A的3個獨立實驗中IFN-β處理后ISG表達定量，歸一化為總蛋白并相對于siCTRL繪圖。
（C） 在IFN-β（24h）處理后穩定過表達FLAG-YTHDF1 WT（Huh7Y1）或W465A（Huh7Y1mut）的Huh7細胞中歸一化為HPRT1的ISG mRNA表達的qRT-PCR分析。
（D） 在模擬或IFN-β（24h）處理之前，用siRNA轉染YTHDF1（siY1）或siCTRL的Huh7細胞提取物的免疫印跡分析。數據代表3個獨立的生物學實驗。
（E） 與IFN-β（8h）處理后Huh7細胞的FLAG-GFP相比，FLAG-YTHDF1 WT（Y1）或W465A（Y1mut）的免疫沉淀（IP）后mRNA富集的qRT-PCR分析。將IP值歸一化為input值并繪制為GFP的倍數富集。
（F） E中使用的FLAG免疫沉淀和input級分的免疫印跡分析。
（5）METTL3/14和m6A促進ISG亞群的翻譯
為鑒定蛋白表達受METTL3/14調節的其他ISG，使用基于定量質譜的蛋白質組學和氨基酸穩定同位素標記（SILAC）來比較IFN-β處理后siCTRL和siMETTL3/14細胞的蛋白質組。與siCTRL相比，siMETTL3/14對蛋白豐度的影響集中在大多蛋白質的對數比為0，表明METTL3/14缺失對IFN-β處理后的蛋白質水平沒有整體影響。在先前的RNA-seq實驗中，將ISG定義為通過IFN-β處理上調>2倍的基因來確定哪些蛋白是ISG。盡管質譜法檢測ISG有限（n=18），但鑒定出一些METTL3/14調節的ISG（圖5A；MS）。METTL3/14缺失后，大多數這些ISG的蛋白表達降低，且這些ISG包括先前鑒定的m6A修飾的IFITM1（對應于IFITM1/2/3的肽）和MX1，以及其他抗病毒ISG如OAS2和不同的HLA-C鏈（圖5A），均由m6A修飾。通過將這些數據與之前的RNA-seq實驗數據進行比較，結果表明METTL3/14對這些ISG蛋白水平的影響不由其mRNA表達調節來確定，因為METTL3/14缺失后，本實驗中在蛋白水平上降低的ISG的mRNA豐度沒有降低，表明翻譯調控如先前對IFITM1和MX1的多核糖體分析所表明結果一致（圖1C和1D；圖5A，RNA）。并非所有通過質譜法鑒定的m6A修飾的ISG都受METTL3/14缺失調節（圖5A；m6A），表明METTL3/14和m6A調節ISG的亞群并支持其蛋白表達。
圖5：METTL3/14調節ISG亞群的翻譯
（A） 3列熱圖顯示了IFN-β處理后METTL3/14缺失對Huh7細胞中ISG表達的影響。第一列顯示定量質譜法檢測蛋白質估計值的log2倍變化（siMETTL3/14與siCTRL + IFN-β 24 h；n=2個生物學重復）。第二列顯示獨立RNA-seq實驗（siMETTL3/14與siCTRL + IFN-β 8 h；n=3個生物學重復）的mRNA reads的log2倍變化。第三列顯示MeRIP-seq數據的m6A狀態（+表示m6A陽性；-表示m6A陰性）（+IFN-β 8h；n=3個生物學重復）。基因包括RNA-seq的IFN誘導超過2倍的任何ISG，這些ISG也可以通過質譜法檢測到，其他圖中的ISG以粗體顯示。由于IFITM1/2/3相似，因此使用此表示法表示從該蛋白質家族中檢測到的肽；RNA-seq倍數變化和m6A狀態對應于帶下劃線的數字，調整后*p<0.05。
（B） METTL3/14缺失對ISG表達影響的四象限散點圖。y軸是Ribo-seq的核糖體保護片段的log2倍變化（siMETTL3/14超過siCTRL），x軸是來自獨立RNA-seq實驗的mRNA讀數的log2倍變化（siMETTL3/14與siCTRL）。m6A修飾（藍色）或m6A陰性（灰色）基因。對其他圖中的ISG進行了標記。
（6）METTL3/14增強了IFN響應的抗病毒作用
METTL3/14在I型IFN響應期間增強ISG亞群表達，表明它可能是最佳抗病毒所必需。研究人員檢測了METTL3/14動態變化后I型IFN限制負義鏈RNA病毒水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）感染的能力。VSV基因組包含了m6Am帽修飾，但由于這種修飾沉積不受METTL3/14調控，因此VSV復制可能不會受到METTL3/14動態變化的直接影響，而對VSV復制的任何影響可能由宿主轉錄本的甲基化介導。通過使用小干擾RNA（siRNA）或過表達來干擾METTL3/14的表達，然后使用顯微鏡在存在和不存在低劑量IFN-β預處理（6h；40U/mL）的情況下，檢測感染后6小時被VSV感染的細胞百分比。在感染后早期時間點檢測VSV感染，可以在感染直接誘導的ISG細胞上調之前檢測到病毒復制。結果顯示，在沒有IFN-β預處理的情況下，任何條件下都沒有看到VSV誘導ISG（圖6A和6B）。通過免疫印跡或定量感染細胞百分比分析來檢測VSV復制，在沒有IFN-β處理情況下，METTL3/14缺失或過表達沒有變化（圖6）。在IFN-β預處理后，METTL3/14缺失導致METTL3/14調節的ISG表達降低（圖6A），而METTL3/14過表達則上調其表達（圖6B）。盡管IFN-β預處理減少了VSV病毒復制，但METTL3/14缺失降低了IFN-β限制VSV的能力，而METTL3/14過表達則會增強IFN介導的VSV限制（圖6）。總之這些數據表明METTL3/14增強了I型IFN的抗病毒特性，是有效IFN介導的抗病毒響應所必需的。
圖6：METTL3/14增強了I型IFN響應的抗病毒作用
（A-B） 用siRNA（A）轉染或穩定過表達FLAG-METTL14的Huh7細胞提取物的代表性免疫印跡分析（n=3），其也增強METTL3表達（M3/14OE）；用IFN-β（6h）或模擬物處理，然后進行VSV感染（MOI=2；6h）（B）。箭頭表示FLAG-METTL14（上）和內源性METLL14（下）。
（C-D） 用siCTRL或METTL3/14 siRNA（C）或穩定過表達FLAG-METTL14（METTL3/14OE；D）處理的Huh7細胞的代表性顯微圖，這些細胞用IFN-β預處理（6h），然后進行VSV感染（MOI=2；6h），對3個獨立實驗感染的細胞百分比進行定量，每個條件5個視野，每個視野>150個細胞，歸一化為未經IFN處理的siCTRL或WT，如右圖所示。比例尺：100μm。
關于易基因RNA m6A甲基化測序(MeRIP-seq)技術
易基因MeRIP-seq技術利用m6A特異性抗體富集發生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結合高通量測序，可以對RNA上的m6A修飾進行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應用于組織發育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷響應、癌癥發生與發展、藥物響應等研究領域；可應用于動物、植物、細胞及組織的m6A檢測。
大樣本量m6A-QTL性狀關聯分析，傳統MeRIP單個樣品價格高，通常難以承擔。易基因開發建立MeRIP-seq2技術，顯著提成IP平行性，實現不同樣本間相對定量，降低檢測成本。
易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化測序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化測序（MeRIP-seq2）
技術優勢：
- 起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
- 轉錄組范圍內：可以同時檢測mRNA和lncRNA；
- 樣本要求：可用于動物、植物、細胞及組織的m6A檢測；
- 重復性高：IP富集重復性高，最大化降低抗體富集偏差；
- 應用范圍廣：廣泛應用于組織發育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷響應、癌癥的發生與發展、藥物響應等研究領域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要運用在分子機制的理論性研究
- 疾病發生發展：腫瘤、代謝疾病（如肥胖/糖尿病）、神經和精神疾病（如阿爾茲海默癥/抑郁癥）、炎癥…
- 發育和分化：早期胚胎發育、個體/組織/器官生長發育、干細胞分化與命運決定、衰老
- 環境暴露與響應：污染、抗逆、生活方式
關于m6A甲基化研究思路
（1）整體把握m6A甲基化圖譜特征：m6A peak數量變化、m6A修飾基因數量變化、單個基因m6A peak數量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修飾基因的功能分析
（2）篩選具體差異m6A peak和基因：差異m6A peak鑒定、非時序數據的分析策略、時序數據的分析策略、差異m6A修飾基因的功能分析、差異m6A修飾基因的PPI分析、候選基因的m6A修飾可視化展示
（3）m6A甲基化組學&轉錄組學關聯分析：Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、m6A修飾目標基因的篩選策略
（4）進一步驗證或后期試驗
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整體解決方案。
參考文獻：
McFadden MJ, McIntyre ABR, Mourelatos H, Abell NS, Gokhale NS, Ipas H, Xhemal?e B, Mason CE, Horner SM. Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine. Cell Rep. 2021 Mar 2;34(9):108798.
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